【论文】以WT1 为靶点的恶性肿瘤主动特异性免疫治疗的临床转化研究进展
以WT1 为靶点的恶性肿瘤主动特异性免疫治疗的临床转化研究进展
Progress of clinical translational research on WT1-targeted active immunotherapy for malignant tumor
陈虹宇，刘春燕，宋婷婷( 江苏奥赛康药业股份有限公司，江苏南京211112)
［作者简介］ 陈虹宇( 1988-) ，女，硕士，工程师，主要从事药学工作，E-mail: iichen0419@ gmail． com
［通信作者］ 刘春燕( LIU Chunyan，corresponding author) ，硕士，工程师，主要从事血液系统肿瘤的治疗与研究，E-mail: liuchunyan@ askpharm．com
[摘要］恶性肿瘤的主动特异性免疫治疗是针对肿瘤细胞相关的抗原靶点，设计使机体产生特异性免疫，从而定向杀灭肿瘤细胞的方法。成肾细胞瘤1( nephroblastoma or Wilm’s tumor 1，WT1) 是2009 年美国国家癌症研究所( National Cancer Institute，NCI) 评估所得的最佳恶性肿瘤抗原。目前，国际上已有多个以WT1 为靶点的恶性肿瘤的主动特异性免疫治疗项目进入了临床转化研究阶段，主要包括多肽疫苗、DC 疫苗和T 细胞产品三类，其中galinpepimut-S、WT-4869、Vaccell 等疫苗均能使恶性肿瘤患者的总生存期大大延长，同时安全性良好。因此以WT1 为靶点的恶性肿瘤的主动特异性免疫治疗是恶性肿瘤治疗的一个有前景的发展方向。本文从WT1 多肽疫苗、DC 疫苗及T 细胞产品三个方面介绍近年来国内外临床转化研究的进展。
［关键词］ 成肾细胞瘤1( WT1) ; 恶性肿瘤; 免疫治疗; 转化医学
［中图分类号］ R730． 51 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1007-385X( 2017) 01-0068-05
恶性肿瘤已成为人类的主要死因之一，预计国2015 年将有281． 4 万人因恶性肿瘤死亡［1］。新兴的免疫治疗方法利用患者自身的免疫系统对抗肿瘤细胞，不仅使患者的生存期大大延长，而且不易耐药或复发，安全性良好［2］。针对肿瘤细胞相关的抗原靶点，设计使机体产生特异性免疫，从而定向杀灭肿瘤细胞的方法又称恶性肿瘤的主动特异性免疫治疗［3］，国际上已有数个此类产品获批上市［4］。恶性肿瘤的主动特异性免疫治疗的关键在于选择合适的抗原靶点，2009 年美国国家癌症研究所( National Cancer Institute，NCI) 分析对比了75 个恶性肿瘤抗原，最终发现成肾细胞瘤1 ( nephroblastoma or Wilm’s tumor 1，WT1) 是最佳的恶性肿瘤抗原［5］。
目前，国际上有11 个以WT1 为靶点的恶性肿瘤的主动特异性免疫治疗项目已进入临床研究阶段，主要分为WT1 多肽疫苗、DC 疫苗以及T 细胞治疗产品。本文就目前其中已有公开数据的6 个有潜力项目的临床转化研究结果进行综述。
1 WT1 多肽疫苗
多肽疫苗的制备最为简单，一般从恶性肿瘤抗原中选取一段，通过氨基酸置换等方式进行结构修饰。修饰后的多肽的免疫原性更强，皮下接种后可激发患者对疫苗发生免疫反应，同时因为交叉免疫，患者的免疫系统对癌细胞的WT1 抗原也可识别并
清除［6-7］。多肽疫苗发挥抗癌作用的机制非常复杂，其在进入体内后还需经过APC 的摄取、加工、MHC Ⅱ分子的合成及荷肽，最终提呈给T 细胞才能清除癌细胞。由于上述步骤较多，过程中的不确定性增强，而且患者的免疫系统存在个体差异，因此并非所有患者都能产生理想的免疫清除作用。根据多肽抗原的种类，多肽疫苗分为单价和多价两类，其中多价疫苗的抗原表位更多，能更好地激发患者的免疫系统。目前在研的多肽疫苗主要有多价的galinpepimut-S 和单价的WT-4869 以及WT-2725，其中galinpepimut-S 在Ⅱ期临床试验中已取得了瞩目的成果［8］，即将开展Ⅲ期临床试验，同时FDA 授予的“快速通道”审评资格可能加快其开发上市的进程，而WT-4869 和WT-2725 尚处在早期临床研究阶段，早期的临床转化研究结果［9］让人们对其未来开发前景保持乐观。
1． 1 Galinpepimut-S
Galinpepimut-S 是瑞士Sellas 生物制药公司开发的一个四价疫苗，设计时利用计算机预测分析，对HLA 关键的A0201 部位结合的蛋白进行氨基酸置换，得到了可能具有对HLA A0201 高亲和力、半衰期更长的多肽。这4 个多肽分别为WT1-A1、427long、331 long 和122A1 long，其长短不一，在WT1 肽链不同肽段的基础上进行了结构修饰，能同时激发CD4 + T 细胞和CD8 + T 细胞的免疫应答，产生CTL对癌细胞进行长期查杀［6-7］。galinpepimut-S 目前在治疗急性髓性白血病( acute myeloid leukemia，AML) 、恶性胸膜间皮瘤( malignant pleural mesothelioma，MPM) 和多发性骨髓瘤( multiple myeloma，MM)的临床转化研究中均取得了可喜的结果，不仅延长了患者的生存期，而且不良反应轻微，具体转化研究的结果总结如下。
Galinpepimut-S 目前已开展了治疗AML 的Ⅰ、Ⅱ期临床试验［10］，分别招募了9 例和22 例经标准治疗达到CR 的AML 患者，受试者分别编入疫苗试验组和对照组，试验组给予galinpepimut-S、Montanide免疫佐剂和GM-CSF; 对照组仅给予Montanide免疫佐剂和GM-CSF。随访发现，Ⅰ、Ⅱ期试验中试验组患者的2 年生存率为79%，与之相比，相同人群的历史经验生存率一般在30% ～ 45% 之间，galinpepimut-S 疫苗使AML 患者的生存期大大延长。根据Sellas 公司最新公布的初步数据，Ⅰ期临床试验中，疫苗组患者的OS 达到5 年以上。Ⅰ期试验早期发表的文献［6］还公布了该疫苗的免疫学应答结果。在CD4 + T 细胞增殖试验中，T 细胞与20 μg /ml 疫苗培养时，331、427、122A1 分别使CD4 + T 细胞增殖了122、57 和9． 9 倍。在IFN-γ ELISPOT 及四聚体染色试验中，WT1-A1 和122A1都使CD8 + T 细胞数目增加。细胞毒性试验进一步证实，WT1-A1 可诱导HLA-A0201 限制性的细胞毒性，可杀灭表达WT1 的癌细胞。galinpepimut-S 的不良反应轻微，患者仅在接种后1 ～ 3 d 内会出现接种部位刺激、肿胀、发红、敏感和瘙痒。此外，galinpepimut-S 治疗AML 的Ⅱ期试验长期随访结果在2016 年6 月的美国临床肿瘤学会( ASCO) 上大放异彩，22 例接种galinpepimut-S 疫苗的AML 患者的平均无病生存期( LFS) 为23． 5 个月，OS 达到了45． 5个月［8］。鉴于上述galinpepimut-S 治疗AML 的良好效果，FDA 于2016 年6 月授予galinpepimut-S 治疗AML 的快速通道审评资格，同时Sellas 公司计划在2016 年下半年开展该疫苗治疗AML 的Ⅲ期临床试验。
Galinpepimut-S 治疗MPM 的Ⅱ期临床试验［7］共纳入了40 例已完成综合治疗的患者，将其分别编入试验组和对照组，试验的设计与上述AML 试验一致，试验组给予galinpepimut-S、Montanide 免疫佐剂和GM-CSF，对照组仅给予Montanide 免疫佐剂和GM-CSF。根据2016 年ASCO 年会新公布的结果，疫苗组患者的OS 高于对照组患者( 21． 4 个月vs16． 6 个月) ; 疫苗组患者的PFS 也高于对照组患者( 11． 4 个月vs 5． 7 个月) ［7］。考虑到对照组患者无获益，伦理委员会命令该试验提前揭盲，并终止对照组。另外，试验中galinpepimut-S 的安全性良好。根据该Ⅱ期试验结果，Sellas 公司计划在2016 年下半年开展治疗MPM 的Ⅲ期试验。
Galinpepimut-S 治疗MM 的Ⅰ/Ⅱ 期临床试验［11］正在进行中，已招募了15 例自体骨髓移植后的MM 患者，其中60%为高风险人群。该单组试验最新公布的结果表明，3 例接种了疫苗的高风险患者出现了积极的免疫反应，其中2 例在随访的1 年中保持缓解，第3 例刚进行了第3 个月的随访，试验继续进行。由于该试验目前结果乐观，Sellas 公司计划在未来开展治疗MM 的Ⅱ/Ⅲ期临床试验。
1． 2 WT-4869 和WT-2725
WT-4869 和WT-2725 这两个疫苗非常相似，目前均由住友大日本制药公司研发，转让自大阪大学医学院的Sugiyama 博士研究团队的成果。目前尚未公开关于这两个疫苗的结构特征，仅基本确定是单价疫苗。这两个疫苗的临床转化研究领域分别有
所侧重，WT-4869 侧重于血液瘤的治疗，而WT-2725则更偏重实体瘤的治疗。WT-4869 在日本开展了治疗骨髓增生异常综合征( myelodysplastic syndrome，MDS) 患者的Ⅰ/Ⅱ期试验［9］，纳入了26 例HLA A2402 表达阳性的MDS患者，其中有17 例为高风险患者，另外9 例为依赖输血的低风险患者，有些患者对一线治疗的阿扎胞苷耐药。该试验采取剂量爬坡的设计，考察的WT4869 剂量范围为5 ～ 1 200 μg /人。根据2015 年12 月美国血液学会( American Socity of Hematology，
ASH) 年会上公布的最新结果［9］，受试者的总体缓解率( 骨髓完全缓解+血液学改善) 为18． 2%，疾病控制率( 骨髓完全缓解+ 血液学改善+ 疾病稳定) 为59． 1%。对阿扎胞苷耐药的高风险患者的初步OS为13． 0 个月，而在目前的治疗方式下该人群的平均OS 为5． 6 个月，WT-4869 使耐药高风险患者的生存期大大延长。在安全性方面，该疫苗耐受性良好。
WT-2725 则是在美国开展了治疗晚期恶性肿瘤的Ⅰ期试验［12］，主要偏重实体瘤。该试验计划招募80 例晚期恶性肿瘤患者，患者需满足WT1 过表达，HLA A0201 或HLA A0206 表达阳性。该试验的目的同样是探索合适剂量，目前尚未公布数据。
此外，通过检索Sugiyama 博士团队此前发表的临床研究文献［13］，发现其研究的多肽结构取自WT1肽的第235 ～ 243 位氨基酸，并将其第2 位的Y 置换为M。该研究团队对多个不同癌种进行了摸索，发现其疫苗对乳腺癌、成胶质细胞瘤和白血病的治疗效果较好。一项早期研究［14］中，有2 例对传统化疗和激素治疗均产生了耐药的乳腺癌患者，在接种试验疫苗后2 例患者的恶性肿瘤均缩小。在同一项研究［14］中，还纳入了10 例白血病患者，试验疫苗作为二线治疗，使7 例患者的成白血病细胞和/或WT1的表达水平下降，1 例患者的疾病稳定。另一项早期研究［15］中，共纳入10 例对其他所有治疗均耐药的不同种类实体瘤患者，接种试验疫苗后，5 例成胶质细胞瘤患者中有1 例部分缓解，另外4 例的疾病均保持稳定。另外，试验疫苗的安全性均良好，不良反应较少。
2 DC 疫苗
DC 是一类非单核吞噬系统细胞，是人体内已知的功能最强的抗原提呈细胞，DC 负责将抗原信息递呈给T 细胞，使T 细胞激活并促进其成熟分化［16］。DC 疫苗的制备较多肽疫苗复杂得多，在体外将患者DC 加工优化后，其可诱导辅助性T 细胞1( T helper cells1，Th1) ，从而激发免疫系统产生恶性肿瘤抗原特异性的CTL，发挥杀灭肿瘤细胞的效果。DC 疫苗疗法属于“个体化治疗”，对每个患者量身定制，需要在体外刺激DC 荷肽。DC 疫苗引发免疫反应的中间过程比多肽疫苗少得多，降低了多肽疫苗发挥作用的不确定性，同时个体化制备也提高了治疗成功率。目前以WT1 为免疫靶点的在研DC 疫苗项目主要有Vaccell 疫苗和安特卫普大学研发的DC疫苗( 未命名) ，由于DC 疫苗需要为每个患者个体化定制，因此临床转化研究的规模一般较小，但这些研究同样证实了DC 疫苗的有效性和安全性。
2． 1 Vaccell 疫苗
Vaccell 疫苗是Tella 公司、东京慈惠会医科大学及韩国的CreGene 公司共同开发的新型DC 疫苗。其制备较为复杂，将外周血单个核细胞( peripheral blood mononuclear cells，PBMC) 置于含有GMCSF和IL-4 的介质中培养，诱导产生成熟的DC。5d 后，用免疫佐剂OK-432 和前列腺素E2 刺激24 h。然后让DC 荷WT1 肽，即制备成功。在该疫苗治疗晚期胰腺癌和非小细胞肺癌( non-small cell lung cancer，NSCLC) 的临床转化研究中，无论是回顾性分析还是小型前瞻性临床试验均发现，DC 疫苗治疗均延长恶性肿瘤患者的生存期，同时DC 治疗的不良反应程度较轻。
Okamoto 等［17］进行了2 项关于DC 疫苗治疗晚期胰腺癌患者的回顾性分析。一项分析观察了49例无法手术的晚期胰腺癌患者，这些患者在标准化疗的基础上( 主要是吉西他滨和S-1) 联用DC 疫苗，从第1 次接种疫苗开始，患者的OS 达到360 d，较标准治疗延长。另一项更大规模的回顾性研究［18］分析观察了255 例同样无法手术的胰腺癌患者，患者同样是接受标准化疗和DC 疫苗的联合治疗，患者从确诊开始计算生存期达到16． 5 个月，从首次接种疫苗开始计算生存期为9． 9 个月。其中有迟发型超敏反应( delayed-type hypersensitivity，DTH) -皮肤反应的患者的OS 显著优于无DTH 的患者( P ＜0. 05) ，因此DTH 阳性患者很可能有临床获益。
为进一步证实回顾性分析的推测，Okamoto等［19］又开展了2 项小型的前瞻性临床试验。一项试验纳入了10 例晚期胰腺癌患者，患者接受吉西他滨和DC 疫苗的联合治疗，这个DC 疫苗仅荷HLAⅠ型限制性的WT1 肽。结果发现，3 例DTH 阳性患
者的疾病得到了控制，同时中性粒细胞/淋巴细胞比( N/L) 呈低水平。另一项试验［5］纳入了10 例Ⅳ期胰腺导管腺癌患者，这些患者需满足HLA-A0201、A0206、A2402，或DRB1-0405、0803、1501、1502，或DPB1-0501、0901 中任一表达阳性。受试者同样接受吉西他滨和DC 疫苗的联合治疗，对照3 例荷HLAⅠ或者Ⅱ型限制性WT1 肽的DC 疫苗治疗的患者，7 例荷HLAⅠ +Ⅱ型限制性WT1 肽的DC 疫苗治疗患者的生存期和PFS 显著延长( 均P ＜ 0． 05) ;而且DTH 阳性患者的生存期和PFS 也显著延长( 均P ＜ 0． 05) 。尤其是3 例DTH 反应强烈的患者( 红疹＞ 5 mm) 的平均生存期长达717 d。
Takahashi 等［20］观察了62 例不可手术或手术后复发的NSCLC 患者，其中47 例HLA 2402 /0201 /0206 阳性患者接种了DC 疫苗，15 例仅接受标准治疗。接种DC 疫苗的患者生存期长于未接种疫苗患者( 14 个月vs 8 个月，P ＜ 0． 05) 。另外，44 例接种疫苗5 次以上患者的生存期长于18 例接种5 次以下的患者( 14 个月vs 2 个月，P ＜ 0． 01) 。多变量分析结果显示，只有疫苗和血红蛋白这两个因素显著影响患者的生存期，接种DC 疫苗可使患者得到显著的生存获益。此外，该疫苗的安全性较好，21%和3%的受试者分别经历了轻微的短暂发热，42%的受试者在疫苗接种部位有短暂红疹，所有不良反应均轻微，未发生严重不良事件。
2． 2 WT1 靶向的自体DC 疫苗
WT1 靶向的自体DC 疫苗目前尚未命名，是比利时安特卫普大学研发的，制备时使用电穿孔技术将WT1 的mRNA 载入患者的DC。该疫苗虽然制备方法独特，但作用机制与Vaccell 疫苗非常类似。其临床转化研究集中在AML 和MPM 的治疗，与galinpepimut-S 相近。几项小规模临床试验发现，恶性肿瘤患者呈现免疫激活、生存期延长，同时DC 疫苗导致的不良反应仅为轻微局部反应。
Tendeloo 等［21］开展了一项Ⅰ/Ⅱ期研究，10 例经多次化疗达到CR 或PR，但仍有很高复发风险的AML 患者接种了该疫苗，结果5 例患者达到了临床缓解，其中3 例患者长期处于缓解状态，CR 状态至少保持了3 年。另外，接种了疫苗的患者WT1 特异性CD8 + T 细胞水平升高，呈现机体免疫激活的特征，该免疫应答与临床缓解紧密相关。该疫苗同样安全性良好，患者在接种部位出现局部红疹和硬结，不良反应轻微。
Berneman 等［22］给10 例不可手术切除的MPM 患者接种DC 疫苗，这些患者之前经铂类/培美曲塞化疗后疾病控制在无进展状态。经过22． 7 个月的随访，受试者的6、12 和18 个月的生存率分别为100%、90%和75%。9 例患者有显著的DTH 反应( 硬结≥10 mm2 ) 。同时，该疫苗耐受性良好，所有患者均在接种部位有局部反应，但均程度轻微，呈自限性。
Berneman 等［23］给17 例AML 患者接种了DC疫苗，这些患者虽然处在缓解状态，但有很高的复发风险。其中有8 例患者达到临床和分子学缓解，这8 例免疫应答阳性患者的生存期远高于无应答患者( 52 个月vs 6 个月，P ＜ 0． 01) ，其无复发生存期也远高于后者( 47 个月vs 3 个月P ＜ 0． 01) 。
3 T 细胞产品
T 细胞产品的治疗机制与前述的多肽疫苗和DC 疫苗不同，它绕过了激活机体内源性免疫应答的过程，直接外源性地输入修饰过的T 细胞而使机体产生即刻抗肿瘤的免疫能力［24］。T 细胞产品的激活过程在体外完成，与在体内激活T 细胞的多肽疫
苗和DC 疫苗相比更容易控制。T 细胞产品在注射人体之后可直接清除肿瘤细胞，其作用确切、成功率更高。T 细胞产品按来源分为自体T 细胞及成品T细胞两类。前者收集患者的T 细胞进行修饰，属于“个体化治疗”，自体T 细胞产品不存在相容性问
题，但体外修饰耗时长且费用昂贵; 后者的T 细胞来自志愿者捐赠，通过将T 细胞的HLA 基因敲除并表达非经典HLA 分子，以阻止NK 细胞介导的细胞识别和溶解，从而得到通用的T 细胞产品，这种T细胞产品可实现较大规模的生产，成本将大大降低。
目前JTCR-016 是全球唯一在研的以WT1 为作用靶点的T 细胞产品，它属于自体T 细胞产品。
JTCR-016 是一款由美国Juno 生物制药公司研发的T 细胞产品，其将患者的T 细胞收集后使用病毒感染针对WT1 的T 细胞受体( T cell receptor，TCR) ，修饰后的T 细胞进入人体后可特异性识别WT1 所在癌细胞，并将其清除。此过程与目前大热
的CAR-T 非常相似，实际上Juno 公司的确以开发CAR-T 见长。该疫苗目前尚在早期临床研究阶段。
一项Ⅰ/Ⅱ期研究［25］刚招募了5 例NSCLC 和MPM患者，截止2016 年4 月20 日已有3 例受试者接种了JTCR-016，其中1 例MPM 患者维持在PR 状态，还有1 例保持疾病稳定。试验中PR 患者的T 细胞扩增最强且持久，由此推测患者出现临床缓解可能与修饰T 细胞的药动学相关。试验中JTCR-016 耐受性良好。另一项Ⅰ期剂量爬坡试验［26］目前招募了11 例AML 患者，这些患者经历了同种异体骨髓移植术，入组时无可检测疾病，但有很高的复发风险。JTCR-016 在该人群中耐受性良好，目前仍未出现患者复发。
4 结语
恶性肿瘤的主动特异性免疫治疗是针对肿瘤细胞相关的抗原靶点，设计使机体产生特异性免疫，从而定向杀灭肿瘤细胞的方法。在2009 年NCI 的一项探寻最佳恶性肿瘤抗原的项目［5］中，WT1 是75 种候选恶性肿瘤抗原中的最佳抗原。目前，国际上正在研发的以WT1 为靶点的恶性肿瘤的主动特异性免疫治疗方法分为多肽疫苗、DC 疫苗和T 细胞产品，均有已进入临床转化研究阶段的产品。通过上述对已公开数据的6 个在研候选药物的临床转化研究结果进行综述，发现galinpepimut-S、WT-4869、Vaccell 等疫苗在治疗AML、MPM、胰腺癌、成胶质细胞瘤、NSCLC 等恶性肿瘤患者时，不仅使患者的OS 大大延长，同时安全性良好，保证了患者的生存质量。从目前的结果来看，WT1 肿瘤疫苗克服了当前肿瘤疗法毒副作用大、易耐药等副作用，给患者带来了巨大获益，是一个大有潜力的恶性肿瘤治疗研究方向。当然，WT1 肿瘤疫苗仍需要科学设计的临床试验对其疗效和安全性进行进一步的考察和确认，才能最终上市，并真正地造福于广大恶性肿瘤患者。
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